基于宏基因组测序体液标本的快速病原检测

期刊年卷：Nat Med 2020 Nov 09

DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-1105-z

作者：Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, Federman S, Gopez A, Reyes K, Zorn K, Sample H, Yu G, Ishpuniani G, Briggs B, Chow ED, Berger A, Wilson MR, Wang C, Hsu E, Miller S, DeRisi JL, Chiu CY,

影响因子：36.13

背景

快速准确的病原学诊断对于临床制定感染患者的干预措施至关重要，由于大多数感染的临床表现难以区分，对广泛的、多元化的诊断技术需求非常迫切。有些微生物在培养过程中很难生长，或无法生长。基于聚合酶链式反应 (PCR) 的分子检测需要提前预设，而针对细菌和真菌的 16S 核糖体 RNA 和 28S-ITS PCR 检测的灵敏度仍需研究。

宏基因组测序可以从临床样本中检测几乎所有已知基因序列的病原体，从感染部位的体液中快速识别病原体是至关重要的。基于 Illumina 测序平台的样本到报告的周转时间为 48-72h。相比之下，纳米孔测序可以在开始测序后几分钟内检测到微生物，整体周转时间小于 6h。

本研究旨在通过一种通用建库方案，同时适用于纳米孔测序平台和 Illumina 测序平台，对不同体液中的游离 DNA(cfDNA) 进行 mNGS 测序，测试样本涵盖低细胞含量的脑脊液，以及高宿主 DNA 含量的脓液，用于评估 mNGS 的检测性能（与传统培养和 PCR 检测进行比较）。

方法

采集 160 例患者的 182 份体液标本，其中脓液 25 例，关节积液 21 例，胸水 32 例，腹水 27 例，脑脊液 35 例，支气管肺泡灌洗液 13 例，其他体液 29 例。在这 182 个样本中，170 个用于评估 Illumina 平台 mNGS 的准确性。连续收集的前 87 个样本被用于比较纳米孔测序和 Illumina 测序。

检测时间

通过开发一套新的适用于纳米孔测序和 Illumina 测序的通用建库方案，Illumina 和纳米孔测序的测序数据量中位数为 7.2M 和 1.1M。使用 SURPI 软件进行数据分析。纳米孔测序需 5 小时的建库准备，平均测序时间为 50 分钟，样本到报告的总时间为~6 小时。 Illumina 测序的总周转时间为~24 小时。

测试准确性

针对对于细菌、真菌病原体的检测性能，使用了两种参考标准进行判定：

1. 培养和 16S PCR 结果组成的临床金标准；

2. 复合标准：（1）同时从同一患者采集的其他样本类型的检测结果；(2) 数字 PCR 测试结果；(3) 由传染病专家 (C.Y.C.) 和临床病理学家 (W.G.) 的独立判断结果。

对于 Illumina 测序，使用临床金标准，mNGS 对细菌检测的灵敏度和特异度分别为 79.2%(95% 可信区间 (CI)73.5-85.2%) 和 90.6%(95%CI 87.3-93.8%)，相比之下，纳米孔测序分别为 75.0%(95%CI 65.0-85.7%) 和 81.4%(95%CI 74.1-89.3%)(图 2C)。当使用复合标准时，Illumina 测序的阳性符合率 (PPA) 和阴性符合率 (NPA) 分别为 80.0%(95%CI 74.1-86.3%) 和 95.3%(95%CI 92.9-97.6%)，而纳米孔测序的阳性符合率 (PPA) 和阴性符合率 (NPA) 分别为 81.0%(95%CI 72.4-89.7%) 和 93.0%(95%CI 88.5-96.7%)。真菌的灵敏度和特异度对于 Ilumina 测序 (n=127) 分别为 90.6%(95%CI 84.2-100%) 和 89.0%(95%CI 85.7-92.5%)，而对于纳米孔测序 (n=127) 分别为 90.9%(95%CI 80.0-100%) 和 100%。

mNGS 诊断感染的潜在临床价值

在 12 例培养和 PCR 为阴性的患者中，有 7 例通过 mNGS 确定了可能的病原体 (克雷伯氏菌、烟曲霉、肺炎链球菌、化脓性链球菌、嗜沙门氏菌、近拟念珠菌和厌氧胃肠道菌群)。另外 2 例由血清学确诊的神经性梅毒和球孢子菌患者，mNGS 成功检测到病原体序列，但低于预先设定的 nRPM 报告阈值。在剩余 3 例患者中，mNGS 漏检了胸水中的新生隐球菌 (由培养阳性的 BAL 液作诊断)、胸水中的结核分枝杆菌 (MTB)(由阳性淋巴结培养作出的诊断) 和芽胞丝状芽胞杆菌 (Sporothrix sp.)。

mNGS 与细菌 16S 和真菌 28S-ITS PCR 的比较

在 160 名患者中有 14 例进行了 16S 或 28S-ITS PCR 检测。其中有 8 例 mNGS 检测结果与 PCR 结果一致。三个不一致的细菌病例中，第一例胸水 16S PCR 检测显示链球菌属，而 mNGS 检测确认肺炎克雷伯菌。第二例体液培养和 16S PCR 检测均为阴性，而从神经外科手术移除的脑深部刺激器 (DBS) 中随后的 mNGS 与培养结果显示产气克雷伯菌呈阳性。第三例不一致病例为脓液，16S PCR 检测禽型分枝杆菌复合体阳性，mNGS 检测阴性。在三个不一致的真菌病例中，体液 mNGS 能够找到致病微生物，而真菌 28S-ITS-PCR 检测为阴性。

体液和血浆 mNGS 诊断的比较

有 7 名患者（携带 9 种病原体），同时进行体液和血浆 mNGS 检测。病原体 cfDNA 含量（nRPM）在局部体液中的中位数是血浆中的 160 倍。

讨论

在 Illumina 和纳米孔测序平台上检测细菌和真菌的灵敏度和特异性是相当的。体液 mNGS 在体液培养和 PCR 检测为阴性的 12 个病例中有 7 例 (58.3%) 检测到病原体，另有 2 例病原体 nRPM 低于阈值，凸显了体液 mNGS 在感染诊断中的潜在用途。此前已发表的研究使用 mNGS 检测脓毒症和肺炎病原体的特异性分别为 63% 和 42.7%，在此研究获得了 83% 到 100% 的总体特异性。

在这项研究中，mNGS 对金黄色葡萄球菌多次漏检，这一差异在纳米孔测序平台上有显著性，但在 Illumina 测序平台上并没有统计学意义。对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度降低被归因于样本中较高水平的宿主 DNA 背景。

对体液中游离核酸的检测相较于去人源（差异化裂解）的优势在于：

1. 由于含有病原体 cfDNA 的上清液在差异裂解过程中被去除，这种富集方法可能不适用于低细胞密度的样品，如血浆和脑脊液。

2. 差异裂解也会阻碍病毒和寄生虫等其他微生物的检测。此外，这些方法涉及多个步骤的裂解和离心，这会增加方法的复杂性，延长检测周转时间。

3. 不需要物理破壁，如玻璃珠匀质。匀质可能会提高对完整真菌和一些含有坚硬细胞壁的细菌的检测，但在临床实验室的常规使用并不方便，而且会增加宿主 DNA 的释放，从而降低微生物检测灵敏度。
血浆游离核酸 mNGS 测序已被用于诊断深层感染。然而，细菌来源的 cfDNA 含量通常很低，约为每毫升血浆 5 个细菌基因组拷贝。研究表明在配对的样本中，体液中观察到的病原体 cfDNA 负荷量是对照组（血浆）的 160 倍。类似地，体液中的肿瘤 ctDNA 含量高于血浆中的 ctDNA。体液中更高水平的病原体 cfDNA 可以提高分析灵敏度，降低所需的测序深度，从而降低检测成本。此外，直接从体液中鉴定病原体可以进行感染定位。
将 mNGS 与细菌 16S 或真菌 28S-ITS PCR 进行比较，14 例 mNGS 阳性患者中仅有 5 例通过 PCR 检出。PCR 和 mNGS 之间不一致的结果也可能是由于体液中游离核酸的长度较短，PCR 无法有效扩增。

结论

使用纳米孔测序可实现小于 6 小时的周转时间，对于脓毒症和重症肺炎等需要快速诊断的患者可能是至关重要的。

mNGS 在以下四种情况有较大的临床价值：(1) 用于鉴定培养阴性或生长缓慢的病原体；(2) 用于诊断罕见感染； (3) 作为危重病人的第一线检测，以及 (4) 作为其他外送检测的替代方案。