柳叶刀子刊 EBioMedicine：mNGS 首次用于同时诊断感染和肿瘤
近日，北京大学人民医院检验科王辉教授团队在国际著名的柳叶刀子刊《EBioMedicine》（IF=8.143）发表了题为 “Metagenomic next-generation sequencing to identify pathogens and cancer in lung biopsy tissue” 的研究论文。王辉教授为本文通讯作者，1331银河在线游戏首页王珺博士和丁文超博士共同参与了此项研究。
不依赖培养、不需前提假设的宏基因组测序已成为诊断感染性疾病的有效方法，并迅速地从实验室研究过渡到临床应用。临床对疑似感染患者进行 mNGS 以识别病原体，但恶性肿瘤患者与感染患者的部分临床症状相似、难以鉴别，对此类患者进行常规 mNGS 检测时，结果可能为阴性。
染色体不稳定性作为一种重要的肿瘤标志物，已在科学研究中进行广泛讨论，但在临床诊断中应用较少。本研究基于 mNGS 可识别宿主染色体不稳定性的原理，对 mNGS 用于同时检测肺活检组织中的病原体和染色体不稳定性进行了研究，并且探讨了基于 Illumina 和 Nanopore 测序平台的宏基因组测序在肺活检组织中的病原体诊断价值。结果显示，以病理结果为金标准，mNGS 对于恶性肿瘤的临床诊断敏感性、特异性、准确率分别为 83.7%、97.6%、92.9%；Illumina 测序在感染诊断中的敏感性和特异性分别为 77.6% 和 97.6%，而 Nanopore 测序的敏感性为 34.7%，特异性为 98.7%。本研究数据显示 illumina 平台在肺活检组织的病原体检测性能显著优于 Nanopore 平台。
一．病人特征
本研究纳入北京大学人民医院检验科 133 例疑似肺部感染或胸部影像学异常的肺活检组织标本，并根据 CAP、HAP 和疑似感染的诊断标准，分为 LRTI 组（Lower respiratory tract infection, n=49）和非 LRTI 组（n=84）。非 LRTI 组的恶性肿瘤发生率明显高于 LRTI 组（41.7% vs. 16.3%），LRTI 组血液病患病率明显高于非 LRTI 组（14.3% vs. 3.6%）。LRTI 组抗生素使用发生率显著高于非 LRTI 组，住院时间较非 LRTI 患者略长，白细胞计数、C 反应蛋白、降钙素原均高于非 LRTI 组。
二、Illumina 和 Nanopore 平台对肺活检组织的病原体检测性能
从标本接收到结果分析，Illumina 测序比 Nanopore 测序的 TAT 长，比常规培养的 TAT 短。培养阳性率为 13.5%（18/133），培养结合其他微生物检测（包括 qPCR、ELISA、GeneXpert MTB/RIF 和组织学检测等）的阳性率为 32.3%（43/133）。Illumina 测序的阳性率为 30.1%（40/133），与培养结果相比，敏感性和特异性分别为 83.3% 和 79.1%；与所有常规微生物检测相比，敏感性和特异性分别为 74.4% 和 95.6%；与综合参考标准相比，敏感性和特异性分别为 77.6% 和 97.6%。Nanopore 测序的阳性率为 14.6%（18/123），去除建库失败标本后，与培养结果相比，敏感性和特异性分别为 38.9% 和 91.4%；与所有常规微生物检测相比，敏感性和特异性分别为 33.3% 和 97.5%，与综合参考标准相比，临床敏感性和特异性分别为 34.7% 和 98.7%。
三、结果不一致的标本信息
整体检测性能比较：133 例肺活检标本中培养到 20 例病原体，其中 2 例标本存在合并感染，8 例标本感染真菌，4 例标本感染抗酸杆菌，其余 8 例标本感染其他细菌。其他微生物检测检出 25 例其他病原体：BALF 培养鉴定 3 例，GM 试验阳性 7 例，抗体阳性 1 例，PCR 检测阳性 14 例。与 Illumina 测序和 Nanopore 测序结果对比发现：仅靠临床常规微生物检测识别病原体 9 例；Illumina 测序额外识别病原体 11 例；Nanopore 测序额外识别病原体 4 例；Illumina 和 Nanopore 测序均阳性，但临床微生物检测结果为阴性的有 3 例；临床微生物检测结果与 Illumina 或 Nanopore 测序结果完全一致的总计 38 例。
真菌检测性能比较：2 例标本的培养结果与 Illumina 和 Nanopore 测序结果均不一致。临床微生物检测和 Illumina 测序均检测到的真菌 7 例；临床微生物检测和 Nanopore 测序均检测到的真菌 1 例；三类方法均检测到的真菌 6 例；与临床微生物检测相比，Illumina 和 Nanopore 测序额外识别了 9 例真菌，且与组织病理结果一致。
分枝杆菌检测性能比较：临床微生物检测检出分枝杆菌 14 例，Illumina 和 Nanopore 测序分别检出 10 例和 2 例，通过 Illumina 测序鉴定了 1 例抗酸杆菌阳性病原体为堪萨斯分枝杆菌。共计 4 例分枝杆菌仅有临床微生物学检出，Illumina 或 Nanopore 测序均未检测到分枝杆菌属，其中 1 例抗酸杆菌阳性，3 例 qPCR 阳性。
四、基于 Illumina 测序的染色体不稳定性检测
通过 Illumina 测序获得标本中的宿主序列，对 127 个肺活检组织标本（43 例组织学上确诊为恶性肿瘤）进行染色体不稳定性分析，对肿瘤进行诊断。mNGS 共检测到 36 例肿瘤患者，其中 31 例为临床和病原 mNGS 检测阴性的患者，5 例为病原体检测阳性患者。与病理检查结果比较，mNGS 对于肿瘤诊断的临床敏感性为 83.7%，特异性为 97.6%，准确率为 92.9%。经临床结果证实，基于 Illumina 平台的 mNGS 同时检测到 38 例感染患者和 36 例癌症患者（包括 18 例初诊肺阴影、占位性病变或结节的患者）。
本研究首次证明了使用 mNGS 可以在肺活检组织标本中同时检测病原体感染和肿瘤。作者指出，基于 Illumina 测序平台的 mNGS，分别以培养、微生物检测和综合参考为标准时，其敏感性较高；而 Nanopore 测序的灵敏度远低于此前报道，原因可能在于肺活检组织中病原体浓度可能低于体液，以及宿主背景（人源含量）较高。
研究发现 mNGS 可提高肺部真菌感染的诊断敏感性，与此前研究结果类似，有利于应对近年来肺部真菌感染发病率上升且早期诊断困难的现象，但作者建议在通过 mNGS 诊断真菌感染时，需结合其他临床检测方法（如 GM 试验或病理检测），以规避 mNGS 汇报背景污染的风险。本研究中 mNGS 对于分枝杆菌的检测敏感性较低，与此前报道不完全一致，可能是由于结核分枝杆菌序列数较低以及不同研究的波动性相关。本研究也对 mNGS 检测到 CMV 和 EBV 的患者进行分析，提出 CMV 和 EBV 在健康人群血液中也可以检出，但疱疹病毒的激活在造血干细胞移植后较常见，且与预后不良有关，因此建议 mNGS 检测到 CMV 或 EBV 时，应根据标本类型和临床症状进行解读。
另外，该研究首次指出，来自 mNGS 的宿主序列可以用于检测肿瘤患者的染色体不稳定性，且有助于提高肿瘤诊断的准确性和时效性（病理检查 TAT 约 48 小时），并降低检测成本，但仍存在少数标本的假阳性（2 例）和假阴性（7 例），因此需要根据更大的队列研究结果对判读阈值进行调整。研究还指出对于 Nanopore 测序平台而言，优势在于序列读长而非序列数量，而人源含量的高低会影响基因组的覆盖度，进而影响染色体不稳定性的判读。因此应用 Nanopore 测序平台的肿瘤判读模型仍要进一步调整。
综上所述，本研究首次报道了基于 Illumina 测序平台的 mNGS 在肺活检组织标本中同时诊断感染和肿瘤。该技术可以有效地对影像学异常如肺部阴影、占位性病变或结节的患者提供肿瘤诊断。本研究建议在 Nanopore 测序的湿实验中进行去宿主操作，以提高病原体的检测敏感性。
